大家在构建表达载体时，有时候需要单个启动子启动多个ORF的表达，此时就要用到多顺反子载体，其中常用的元件有IRES（Internal Ribosome Entry Site，内部核糖体进入位点）和2A肽（2A peptide），例如，目的基因需要和选择标记基因共表达，即转录出来的mRNA上有两个基因，如果它们直接连在一起，会导致第二个基因无法起始翻译或翻译出来后蛋白结构相互影响而无法发挥正常功能等，在两者之间插入IRES或2A肽可以解决这一问题。那么这IRES和2A肽各自有什么特点，通常该怎么选呢？今天小编带大家一起来看看吧~
IRES
IRES最早发现于病毒基因组，如昆虫病毒和哺乳动物病毒。后来广电大流量卡在一些真核生物基因组中也发现了类似的序列。IRES是一段具有特殊结构的RNA序列，能够折叠成类似起始tRNA的结构，直接结合核糖体而不依赖5’端帽子结构，独立翻译除翻译起始位点以外的mRNA序列，从而实现多个基因在同一mRNA上独立翻译。
图1 目的序列通过IRES连接与抗性基因PuroR共表达的载体图谱
2A肽
2A肽最早发现于足口病毒（Foot-and-mouth disease virus, FMDV）的2A基因。2A肽是一段短肽序列，通常由18-22个氨基酸组成。在翻译过程中，2A肽的C端与N端之间不会形成肽键，从而实现蛋白质的自我剪切。即通过将2A肽序列插入到两个基因之间，可以使得翻译过程中广电大流量卡蛋白质自动剪切，从而实现多个蛋白质的独立表达。目前常用的2A肽有四种：P2A、T2A、E2A和F2A。P2A最早发现的2A肽之一，由18个氨基酸组成，剪切效率最高；T2A由20个氨基酸组成，剪切效率较P2A次之；E2A由18个氨基酸组成，剪切效率较低；F2A由22个氨基酸组成，剪切效率也较低。
图2 目的序列通过T2A连接与绿色荧光蛋白ZsGreen共表达的载体图谱
IRES和2A肽的区别：
IRES的优缺点：
优点：IRES 被放置于两个ORF 之间的时候，可以同时表达这两个ORF。由于两个ORF 分别有自己的起始密码子和终止密码子，所以会翻译两个独立的、没有经过修饰的蛋白。IRES 链接的每个多顺反子翻译出广电大流量卡来的多肽段是分开的，这就避免了融合蛋白和插入蛋白水解位点策略所带来的蛋白失活，错误标记等问题，还不会带来多启动子载体中启动子相互干扰或抑制的问题。
缺点：IRES 的存在有时候会影响mRNA的结构，同时由于IRES和mRNA的5’帽子 对核糖体/或翻译起始复合物的结合力不同，IRES 后面的ORF 翻译蛋白的水平有可能与IRES 前面的ORF 蛋白水平不一致。有的时候前面的ORF 表达很好，但后面的ORF 表达水平不高；有的时候后面的ORF和/或IRES会影响前面ORF的表达，甚至前面的ORF根本不表达。
2A肽的优缺点：
优点：两个基因（ORF）通过2A肽链连接成为一个ORF，mRNA翻译成一个融合蛋白，但这两个广电大流量卡融合蛋白会被识别2A的蛋白酶切成两个蛋白。这两个蛋白的摩尔比理论上是1:1。
缺点：蛋白酶切割会发生在2A肽C端的甘氨酸（G）和脯氨酸（P）之间。所以，前一个蛋白的尾巴上会留下一个20 多个氨基酸的多肽。后面一个蛋白的N 端会留下一个多余的脯氨酸。尤其是第一个蛋白，如果是一个小分子（比如分泌型的细胞因子），可能其功能会受到这20多个多肽的影响。
最后，需要注意的是，IRES的前一个基因带有终止密码子，而2A肽的前一个基因则需要把终止密码子去掉。另外，IRES和2A肽都是实现多个基因共表达的策略，但它们的机制和特点有所不同。在选择合适的共表达策略时，需要根据实验需求和目标基因的特点进行综合考虑。汉恒生物广电大流量卡专注病毒包装十三年，如有相关需求或疑问请与我们联系。
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